Mikroskopia fluorescencyjna to potężna technika, która pozwala naukowcom wizualizować określone cząsteczki i struktury w komórkach i tkankach. Aby przygotować próbki do mikroskopii fluorescencyjnej, często stosuje się mikrotom kriostatowy do wycinania cienkich skrawków zamrożonej tkanki. W tym poście na blogu podzielę się spostrzeżeniami na temat wykorzystania mikrotomu kriostatowego do mikroskopii fluorescencyjnej, opierając się na moim doświadczeniu jako dostawcy mikrotomu kriostatowego.
Zrozumienie mikrotomu kriostatu
Mikrotom kriostatowy to wyspecjalizowany instrument przeznaczony do cięcia cienkich skrawków zamrożonej tkanki w niskich temperaturach. Składa się z ostrza tnącego, uchwytu na próbki i komory o kontrolowanej temperaturze. Niska temperatura pomaga zachować strukturę tkanki i zapobiega degradacji cząsteczek fluorescencyjnych.
Na rynku dostępne są różne typy mikrotomów kriostatowych. Na przykładKriotomoferuje precyzyjne możliwości cięcia, podczas gdyKriostaty Półautomatycznezapewnia dobrą równowagę pomiędzy automatyzacją i kontrolą użytkownika. NaszMikrotom kriostatowyłączy w sobie zaawansowane funkcje, aby sprostać różnorodnym potrzebom badaczy.
Przygotowanie mikrotomu kriostatu
Przed użyciem mikrotomu kriostatu istotne jest jego odpowiednie przygotowanie. Najpierw wyczyść ostrze tnące i uchwyt preparatu, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Aby zapewnić dokładne czyszczenie, użyj odpowiedniego roztworu czyszczącego i miękkiej szczotki.
Następnie należy ustawić temperaturę komory kriostatu. Idealna temperatura zależy od rodzaju wycinanej tkanki. Ogólnie rzecz biorąc, dla większości tkanek odpowiednia jest temperatura od -18°C do -25°C. Przed kontynuowaniem poczekaj, aż kriostat osiągnie ustawioną temperaturę.
Przygotowanie próbki tkanki
Jakość przygotowania próbki tkanki ma kluczowe znaczenie dla powodzenia mikroskopii fluorescencyjnej. Zacznij od utrwalenia tkanki w odpowiednim utrwalaczu. W mikroskopii fluorescencyjnej powszechnie stosuje się utrwalacze, takie jak paraformaldehyd, ponieważ dobrze utrwalają sygnały fluorescencyjne.
Po utrwaleniu tkankę należy poddać kriozabezpieczeniu. Polega to na zanurzeniu tkanki w roztworze środka krioprotekcyjnego, takiego jak sacharoza, aby zapobiec tworzeniu się kryształków lodu podczas zamrażania. Tkankę następnie zamraża się w odpowiednim ośrodku zamrażającym, takim jak związek OCT.
Mocowanie tkanki na uchwycie próbki
Po zamrożeniu tkankę należy zamontować na uchwycie próbki. Ostrożnie umieść zamrożony blok tkanki na uchwycie próbki i zabezpiecz go za pomocą odpowiedniego urządzenia mocującego. Aby zapewnić dokładne cięcie, upewnij się, że chusteczka jest wyśrodkowana i mocno przymocowana do uchwytu.
Ustawianie parametrów przekroju
Przed rozpoczęciem procesu cięcia należy ustawić parametry cięcia na mikrotomie kriostatu. Parametry te obejmują grubość przekroju, prędkość cięcia i prędkość posuwu. Grubość skrawku zależy od rodzaju tkanki i wymagań doświadczenia z mikroskopią fluorescencyjną. W przypadku większości zastosowań odpowiednia jest grubość przekroju 5–10 mikrometrów.
Szybkość cięcia i posuw należy dostosować w zależności od twardości tkanki. Miękkie tkanki mogą wymagać mniejszej prędkości cięcia i mniejszej prędkości posuwu, podczas gdy twardsze tkanki mogą tolerować większą prędkość cięcia.
Dzielenie tkanki
Po ustawieniu parametrów rozpocznij proces cięcia. Powoli przesuwaj uchwyt preparatu w stronę ostrza tnącego. Gdy ostrze przetnie tkankę, powstaną cienkie skrawki. Użyj cienkiego pędzla lub podnośnika do skrawków, aby ostrożnie przenieść skrawki na szkiełko.
Ważne jest, aby obchodzić się z sekcjami delikatnie, aby uniknąć uszkodzeń. Upewnij się, że sekcje są równomiernie rozmieszczone na slajdzie i nie zachodzą na siebie.
Barwienie fluorescencyjne skrawków
Następnym krokiem po pocięciu jest wybarwienie skrawków barwnikami fluorescencyjnymi. Dostępne są różne barwniki fluorescencyjne do różnych zastosowań, takie jak DAPI do barwienia jądrowego i barwniki Alexa Fluor do specyficznego znakowania białek.
Przygotować roztwór barwiący zgodnie z instrukcją producenta. Inkubować skrawki w roztworze barwiącym przez odpowiedni czas. Po zabarwieniu dokładnie umyj skrawki, aby usunąć nadmiar barwnika.
Montaż barwionych sekcji
Po zabarwieniu skrawków należy je umieścić na szkiełku nakrywkowym. Użyj odpowiedniego środka do mocowania, który jest kompatybilny z barwnikami fluorescencyjnymi. Na wybarwione skrawki nałóż kroplę środka zamykającego i ostrożnie opuść szkiełko nakrywkowe na szkiełko, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.
Obrazowanie sekcji
Na koniec wybarwione skrawki są gotowe do mikroskopii fluorescencyjnej. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i dostosuj ostrość i powiększenie, aby uwidocznić sygnały fluorescencyjne. Użyj odpowiednich filtrów, aby wykryć różne barwniki fluorescencyjne.
Rozwiązywanie problemów i wskazówki
- Jakość sekcji: Jeśli kawałki są pomarszczone lub podarte, sprawdź ostrze tnące pod kątem stępienia lub uszkodzenia. Ostre ostrze jest niezbędne do produkcji wysokiej jakości przekrojów.
- Sygnał fluorescencyjny: Jeśli sygnał fluorescencyjny jest słaby, sprawdź protokół barwienia. Upewnij się, że czas barwienia i stężenie barwnika są odpowiednie. Upewnij się także, że skrawki nie są nadmiernie umyte, ponieważ może to zmniejszyć sygnał fluorescencyjny.
- Kontrola temperatury: Utrzymuj stabilną temperaturę w komorze kriostatu przez cały proces cięcia. Wahania temperatury mogą mieć wpływ na jakość kształtowników.
Kontakt w sprawie zakupu i konsultacji
Jeśli jesteś zainteresowany zakupem mikrotomu kriostatowego do potrzeb mikroskopii fluorescencyjnej lub masz jakiekolwiek pytania dotyczące jego zastosowania, skontaktuj się z nami. Nasz zespół ekspertów jest gotowy pomóc Ci w znalezieniu odpowiedniego instrumentu do Twoich badań.
Referencje
- Histologia: tekst i atlas Michaela H. Rossa i Wojciecha Pawliny.
- Mikroskopia fluorescencyjna: zasady, techniki i zastosowania, Richard P. Haugland.